Studying effectors, a way to discover new targets for anti-powdery mildew phytotherapies?

Los oídios son la principal causa de enfermedad en plantas de origen fúngico. Estos patógenos desarrollan una estructura especializada en el interior de la célula huésped denominada haustorio. A través de esta estructura establecen una estrecha relación con el hospedador valiéndose de unas pequeñas proteínas secretadas llamadas efectores, para eludir la respuesta de defensa de la planta, modular la fisiología de la célula vegetal y regular la expresión génica. Debido al estilo de vida como biotrofos obligados, el estudio funcional de los efectores requiere de técnicas específicas e indirectas como el silenciamiento génico inducido por el hospedador (HIGS). El objetivo principal de analizar la función de los efectores y su papel en la patogénesis es identificar aquellos con un papel importante en el establecimiento de la enfermedad que puedan resultar dianas interesantes para el desarrollo de nuevos fitosanitarios.

Powdery mildews are the main cause of disease in plants of fungal origin. These pathogens develop a specialized structure inside the host cell named haustorium. Through this structure, they establish a close relationship with their hosts using small secreted proteins called effectors, to bypass the plant defense responses of the plant, modulate the physiology of the plant cell and regulate gene expression. Due to their lifestyle as obligate biotrophs, the functional study of powdery mildew effectors requires specific and indirect techniques such as host-induced gene silencing (HIGS). The main objective of analyzing the function of effectors and their role in pathogenesis is to identify those with an important role in the establishment of the disease that may be interesting targets for the development of new phytosanitary tools.

Los oídios

Entre las enfermedades causadas por hongos, los oídios constituyen probablemente el grupo de enfermedades más importantes de nuestros cultivos. Estas enfermedades, comúnmente conocidas como cenizas o cenicillas, son causadas por hongos ascomicetos de la familia Erysiphaceae, infligiendo importantes pérdidas tanto en la cantidad y calidad de los cultivos.

Estos hongos patógenos están ampliamente distribuidos en la naturaleza, infectando una gran variedad de especies de plantas tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas, destacando por su importancia económica Blumeria graminis f. sp. hordei (oídio de la cebada), Blumeria graminis f. sp. tritici (oídio del trigo), Erysiphe necator (oídio de la vid), y Podosphaera xanthii (oídio de las cucurbitáceas). Las enfermedades causadas por los oídios se caracterizan por la aparición de manchas blanquecinas pulverulentas fácilmente reconocibles (Figura 1A). Estos patógenos, debido a su peculiar estilo de vida como biotrofos obligados, no matan directamente a su huésped, ya que necesitan de las células vivas del mismo para establecerse y proliferar (Figura 1B). Esto se debe a que desarrollan una estructura especializada en el interior de la célula huésped denominada haustorio (Figura 1C-D), estableciendo una íntima relación con su hospedador^[1].

Uno de los mayores desafíos que enfrentan los agricultores y los investigadores es el manejo de las enfermedades causadas por los oídios. Desafortunadamente, estos patógenos presentan una gran capacidad de adaptación y han conseguido desarrollar resistencias frente a un gran número de fitosanitarios^[2]. Por ello, la identificación de los aspectos clave que subyacen a las interacciones moleculares patógeno-huésped puede ser un camino que permita el desarrollo de fitoterapias alternativas en el futuro, sin embargo, el estilo de vida de los oídios como biotrofos obligados representa un obstáculo importante para los investigadores, que ha limitado el estudio y la comprensión de la biología celular y molecular de estos patógenos.

Efectores: moderadores en el diálogo patógeno-planta

Para mantener una estrecha relación con el huésped a través del haustorio, el patógeno tiene que manipular los mecanismos de defensa de la planta para evitar ser reconocido, modulando las respuestas defensivas de la misma. Para ello, estos patógenos se sirven de una amplia batería de proteínas relacionadas con virulencia denominadas efectores. Los efectores son pequeñas proteínas secretadas por el patógeno que alteran la estructura de la fisiología de la célula huésped, modulan la respuesta de defensa de la planta y protegen la integridad fúngica para permitir la colonización y proliferación.

Tan diversa es su localización en la célula huésped como es su papel en la interacción planta-patógeno. En el caso de otros hongos filamentosos se han descrito funciones tan diversas que van desde la protección y ocultación de la pared celular del hongo como es el caso de Avr4 y Ecp6 de Cladosporium fulvum, inhibición de la inmunidad en planta por Pep1 de Ustilago maydis o la inhibición de proteasas apoplásticas por Avr2 de C. fulvum. En el caso de los oídios, recientemente se han identificados varios efectores en B. graminis como BEC4 y BEC1011 que interfieren en el tráfico de vesículas asociado a defensa y a la muerte celular programada, respectivamente^[3]. Sin embargo, a pesar de que hay más de 820 especies de oídios, se sabe muy poco acerca de su genética y mucho menos sobre el número y función de sus efectores. En los últimos años, con los avances en las tecnologías de secuenciación masiva NGS, el número de efectores candidatos identificados en las especies de oídios más estudiadas y analizadas ha experimentado un enorme crecimiento. Sin embargo, y como viene siendo habitual, el estilo de vida de estos patógenos como biotrofos obligados se interpone en el estudio funcional de estos efectores.

¿Cómo abordar el estudio de los efectores de oídios?

En los últimos años se han desarrollado metodologías alternativas para llevar a cabo la identificación y análisis de genes de efectores candidatos de oídios, que permiten superar la problemática impuesta por su peculiar estilo de vida. Una de las estrategias para el estudio de los efectores es la manipulación genética. En otras especies de hongos filamentosos, se han empleado diferentes técnicas de transformación como la transformación de protoplastos mediante polietilenglicol (PEG), el bombardeo de partículas, la electroporación, la transformación vírica y la transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens (ATMT)^[4]. Sin embargo, nuevamente condicionado por su estilo de vida, algunas de estas técnicas no pueden ser empleadas para la transformación de los oídios, además de presentar importantes limitaciones. Este es el caso de la biobalística y la electroporación, dos métodos que han sido empleados para la transformación de numerosos hongos filamentosos entre los que se incluyen los oídios B. graminis y P. xanthii. Sin embargo, estos métodos han resultado poco reproducibles, además de resultar métodos demasiado agresivos con las conidioesporas de los oídios^[5]. En las dos últimas décadas ha ganado gran interés un nuevo método de transformación de hongos filamentosos basado en el uso de A. tumefaciens. Recientemente, el sistema ATMT ha sido empleado para la transformación de P. xanthii resultando ser un método inofensivo y reproducible que puede superar las limitaciones técnicas de otras aproximaciones, abriendo una nueva ruta para el estudio de la secreción y localización de los efectores de oídios, entre otras posibilidades^[4].

Sin embargo, a pesar de haberse puesto a punto un método de transformación de P. xanthii mediante A. tumefaciens, debido al estilo de vida como biotrofos obligados, la manipulación genética de los oídios presenta ciertas limitaciones, por ejemplo, la construcción de mutantes. Cuando se trata de la deleción o de la disrupción de un gen de un efector candidato, en el caso de los oídios aflora un importante problema ya que los transformantes no pueden seleccionarse desde una placa de Petri, sino que su selección tiene que ser directamente sobre el soporte vegetal. ¿Qué pasaría si se trata de un efector esencial para el desarrollo de la enfermedad? En ese caso no habría crecimiento pero resultaría imposible determinar si el efecto negativo sobre la patogénesis es debido a la carencia del efector. Por ello, se han desarrollado nuevos métodos indirectos para el estudio de los efectores como es el caso del conocido como silenciamiento génico inducido por el hospedador o HIGS, su acrónimo en inglés.

Actualmente, el sistema HIGS ha surgido como una herramienta eficaz para caracterizar la participación de un efector candidato en el establecimiento de la enfermedad causada por hongos biotrofos obligados. Este método se basa en la estrecha relación que el patógeno mantiene con su huésped y en la capacidad del patógeno para tomar ARN bicatenario (ARNds) o pequeños ARN interferentes (ARNsi) a través de las estructuras de absorción de nutrientes (el haustorio en el caso de los oídios) y el posterior silenciamiento del gen. De esta forma, se determina el papel del efector en la patogénesis mediante el análisis del crecimiento del patógeno, por ejemplo, evaluando el número de haustorios desarrollados tras el silenciamiento, o de la acumulación de compuestos de defensa de la planta (calosa, lignina, H₂O₂, etc). De esta forma, se ha observado que el silenciamiento puede repercutir de distinta forma en la respuesta de la planta y en el crecimiento del hongo según lo determinante que sea un efector para el desarrollo de la enfermedad. Hasta la fecha, en el caso de los oídios, se ha empleado el sistema HIGS para el análisis funcional de 126 efectores candidatos de B. graminis durante el establecimiento de la enfermedad, de los cuales 13 fueron identificados por contribuir al establecimiento de la infección^[6]. Este método es, sin lugar a dudas, una herramienta muy importante para llevar a cabo el principal objetivo del estudio de los efectores, la identificación de aquellos que juegan un papel esencial en el desarrollo de la enfermedad.

Perspectivas futuras

El estudio de los efectores de los oídios supone un reto para los investigadores y la llave principal para determinar los aspectos clave de la interacción hongo-planta. En la actualidad, con el aumento del número de genomas y transcriptomas de especies de oídios disponibles, la identificación de nuevos efectores candidatos con participación en el establecimiento de la enfermedad experimentará un aumento considerable en el futuro. Además, la puesta a punto de herramientas para la manipulación genética de los oídios, suponen un importante salto para abordar el estudio de las bases moleculares de la interacción hongo-planta. En el caso particular de los oídios, el desarrollo de nuevas tecnologías para abordar el estudio funcional de los efectores permitirá identificar aquellos que tienen un papel clave en el establecimiento de la enfermedad, o lo que es lo mismo, permitirá la identificación de dianas para el desarrollo de nuevas herramientas fitosanitarias con un espectro de acción más reducido pero con una mayor especificidad.

Referencias

1. Martínez-Cruz J y otros. The Podosphaera xanthii haustorium, the fungal Trojan horse of cucurbit-powdery mildew interactions. Fungal Genet Biol 71: 21-31, 2014.
2. Pérez-García A y otros. The powdery mildew fungus Podosphaera fusca (synonym Podosphaera xanthii), a constant threat to cucurbits. Mol Plant Pathol 10: 153-160, 2009.
3. Lo Presti L y otros. Fungal effectors and plant susceptibility. Annu Rev Plant Biol 66: 513-545, 2015.
4. Martínez-Cruz J y otros. Transformation of the cucurbit powdery mildew pathogen Podosphaera xanthii by Agrobacterium tumefaciens. New Phytol 213: 1961-1973, 2017.
5. Vela-Corcía D y otros. Transient transformation of Podosphaera xanthii by electroporation of conidia. BMC Microbiol 15: 20.a, 2015.
6. Pliego C y otros. Host-induced gene silencing in barley powdery mildew reveals a class of ribonucleases-like effectors. Mol Plant Microbe Interact 26: 633-642, 2013.